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UmweltmikrobiologieFWF Projekt

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FWF Projekt

Bakterielle Konjugation: Studien der Mechanismen des konjugativen Plasmidtransfers in Gram-positiven Bakterien (vereinfachter Typ IV-Sekretionsmechanismus), (FWF, Kooperationsprojekt mit Prof. Dr. W. Keller, Karl-Franzens-Universität Graz)

Lupe

Der Transfer von Plasmid DNA mittels bakterieller Konjugation in Gram-negativen (G-) Bakterien war in den letzten Jahrzehnten Gegenstand umfangreicher Studien, während die Mechanismen der Konjugation in Gram-positiven (G+) Bakterien weitaus weniger untersucht worden sind. In den letzten Jahren wurden die kompletten Nucleotid-Sequenzen einiger konjugativer Resistenz-Plasmide von G+ Bakterien bestimmt, die eine modulare Organisation der Transferregionen und eine starke Konservierung von vermeintlichen Transfergenen aufwiesen. Einige dieser Gene weisen Homologien zu Bestandteilen von Typ IV Sekretionssystemen in G- Bakterien auf. Konjugativer Plasmidtransfer und Sekretion von Toxinen von verschiedenen G- (pathogenen) Bakterien laufen nach dem Typ IV Sekretionsmechanismus ab. Die Transferregion des Multiresistenz-Plasmides pIP501, eines "broad-host-range" konjugativen Plasmides aus G+ Bakterien, ist in einem Operon organisiert, das für 15 putative Transferproteine codiert. Im Rahmen dieses Projektes sollen alle 15 Genprodukte exprimiert und gereinigt und auf Löslichkeit und Sekundärstruktur getestet werden. Alle löslichen Proteine werden einem Kristallisations-Screening unterzogen. Proteine, die aus diesen Tests als geeignete Kandidaten für Strukturbestimmung hervorgehen, werden im präparativen Maßstab exprimiert und gereinigt werden. Drei Proteine der pIP501- tra-Region, die Homologien zu Typ IV Proteinen von G- Bakterien aufweisen, eine ATPase, ein "Coupling Protein" und eine vermeintliche lytische Transglykosylase werden funktionell charakterisiert werden. Extensive Kristallisationsversuche werden mit den drei Typ IV homologen Proteinen und anderen Proteinen des tra-Operons durchgeführt werden, für welche anhand von Hefe 2-Hybrid Untersuchungen und Interaktionsstudien (pull-down assay) eine Schlüsselfunktion im konjugativen Transfer postuliert wird. Zur Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen zwischen den Komponenten des Konjugationssystems werden biophysikalische Methoden verwendet werden. Ziel dieses Projekts ist die funktionelle und strukturelle Charakterisierung der Proteinkomponenten und deren Bedeutung für die Assemblierung eines Typ IV ähnlichen Sekretionssystems in G+ Bakterien.

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