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TU Berlin

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Konjugativer DNA Transfer zwischen Gram-positiven und Gram-negativen Spezies: Transferkomponenten des Multiresistenzplasmids pIP501 aus Streptococcus agalactiae
Citation key Kurenbach2004
Author Kurenbach, Brigitta
Year 2004
School Technische Universität Berlin, FG Umweltmikrobiologie
Abstract Das konjugative Resistenzplasmid pIP501 gehört zur Inkompatibilitätsgruppe Inc18 und weist einen breiten Wirtsbereich in Gram-positiven Bakterien auf, zu denen humanpathogene Keime sowie biotechnologisch relevante Spezies gehören. Seine Größe beträgt 30.599 bp, und es enthält 32 offene Leserahmen mit einer Größe von mehr als 90 AS. Mittels Kreuzungsversuchen auf halbfesten Oberflächen konnte konjugativer Transfer von pIP501 von Enterococcus faecalis sowohl nach Streptomyces lividans als auch nach Escherichia coli gezeigt werden. Replikations-, Resistenz- und Transferfaktoren sind in beiden neuen Wirten funktionell. Dies ist der erste Nachweis konjugativen Transfers eines natürlich vorkommenden Plasmids zwischen diesen Organismen. Die Sequenzierung des bisher unbekannten Abschnitts von pIP501 stromabwärts von orf6 der Transfer (tra)-Region zeigte das Vorhandensein von neun weiteren offenen Leserahmen (orf7-orf15). Die Genprodukte Orf5, Orf7 und Orf10 zeigen Ähnlichkeiten mit Komponenten von Typ VI Sekretionssystemen. Das sich orf15 anschließende Gen ist der ?Copy-Number? Repressor copR. Mit 15,07 kb umfasst die tra-Region fast die Hälfte des gesamten Plasmids, dessen Gesamtsequenz mit Hilfe der neuen Daten assembliert werden konnte. Mittels RT-PCR konnte gezeigt werden, dass die tra-Region eine transkriptionelle Einheit darstellt. Ein putativer rho-unabhängiger Terminator stromabwärts von orf15 wurde postuliert, die Transkription endet mit orf15. Der Transkriptionsstartpunkt der tra-Region liegt etwa 120 bp stromaufwärts des putativen Startcodons von orf1 innerhalb des oriT. Der abgeleitete Promotor Ptra überlappt teilweise mit benachbarten inverted repeat Strukturen. Zusammengenommen ergeben diese Daten einen extrem kompakten Aufbau von oriT/Ptra, welcher auf eine negative Autoregulierung der Region durch die von orf1 codierte TraA DNA-Relaxase hinweisen könnte. Semi-quantitative RT-PCR wurden durchgeführt, um den Einfluss der Zelldichte auf die Regulation des tra-Operons zu untersuchen. Unter den untersuchten Bedingungen ist die Regulation wachstumsphasenunabhängig. Die postulierte Relaxase-Funktion von TraA wurde in vitro bewiesen. TraA (662 AS) und ein verkürztes Protein TraA293, das die N-terminalen 293 AS von TraA umfasst, wurden in in vitro Cleavage Assays eingesetzt und bezüglich ihres Temperaturoptimums sowie der Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen charakterisiert. TraA ist das einzige Protein, das für die Nicking-Aktivität an oriT in vivo und in vitro notwendig ist.
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