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Verhalten von gentechnisch veränderten Mikroorganismen in Trink- und Flußwasserbiofilmen
Citation key Hangen2001
Author Hangen, Frauke Rena
Year 2001
School Technische Universität Berlin, FG Umweltmikrobiologie
Abstract Der gentechnisch veränderte Organismus (GVO) P. putida FH1 wurde aufgrund seiner Eigenschaft, Biofilme zu bilden und in Biofilmen zu wachsen, als Modellorganismus gewählt. Der Stamm enthielt das selbst-transferierende, mit dem Gen des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP) markierte Plasmid pJB20. In Parallelexperimenten wurde der Wildtyp P. putida KT2442 eingesetzt. Beide Stämme konnten mit der neu-entwickelten 16S rRNA Sonde PPU646 spezifisch hybridisiert werden. In künstliche Biofilme aus Trinkwasserbakterien konnte sich P. putida FH1 nicht einlagern, während in ausgewählten Substraten eine enge Vergesellschaftung auch von P. putida KT2442 mit dem Trinkwasserisolat A. commune beobachtet wurde. In der mit Trinkwasser kontinuierlich durchströmten Robbins Device wurde P. putida KT2442 14 bzw. 28 Tage nach der Exposition frischer Polyethylen-Oberflächen inokuliert und konnte 27 bzw. 8 Tage in den Biofilmen detektiert werden. Die phylogenetische Zusammensetzung und Dichte der Biofilme veränderte sich in den 28 Tage alten Biofilmen signifikant. Als Medium mit höherer Substratkonzentration und Organismendichte wurde Wasser aus dem Landwehrkanal (LW-Wasser) verwendet. In nicht-sterilen Flüssigkulturen blieben P. putida KT2442 und P. putida FH1 über 200 Tage kultivierbar. Im Vergleich von stationären mit spät-logarithmischen Kulturen zeigten erstere keine Adaption an das LW-Wasser. Die Inkubation in LW-Wasser machte beide Organismen resistenter gegen Streß in Form von Gefrieren. Die Biofilmexperimente mit Landwehrkanal-Wasser wurden in 1l-Biofilmreaktoren im semi-batch Betrieb durchgeführt. P. putida KT2442 bzw. P. putida FH1 konnte durch spezifische in situ Hybridisierung mit der neuen Sonde PPU646 32 Tage, durch GFP-Expression 60 Tage und durch selektive Kultivierung 147 bzw. 183 Tage nachgewiesen werden. In bereits entwickelten Biofilmen lagerten sich P. putida KT2442 bzw. P. putida FH1 mit hoher Zellzahl an, gefolgt von einer zweistufigen Abnahme. Der Verlauf wurde übereinstimmend mit allen Detektionsmethoden gezeigt und weitgehend übereinstimmend für beide Organismen. Die Zugabe von P. putida KT2442 bzw. P. putida FH1 veränderte die LW-Biofilme nicht signifikant. Die Konjugation Rifampicin-resistenter Mutanten des Trinkwasserisolates A. citratiphilum mit P. putida FH1 unter Laborbedingungen ergab GFP-markierte Transkonjuganten. In den Flüssigkulturen mit LW-Wasser kam es zum Transfer des Plasmids pJB20 von P. putida FH1 auf autochthone, vorher unbekannte Spezies. Die Konjugationen wurden durch einen Antibiotika-Test, den immunologischen Nachweis des GFPs und die spezifische Amplifikation von auf dem Plasmid kodierten Genabschnitten bestätigt. Die Transkonjuganten wurden durch gruppenspezifische in situ Hybridisierung als beta-Proteobakterien klassifiziert und nach der Sequenzierung der jeweiligen 16 S rDNA als neue Spezies identifiziert.
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