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Untersuchungen zur Bildung von Sekundärmetaboliten und extrazellulären Enzymen bei Eisenbakterien mittels (molekular)biologischer und chemischer Screeningverfahren
Zitatschlüssel Alramo2011
Autor Alramo, Abir
Jahr 2011
Schule Technische Universität Berlin, FG Umweltmikrobiologie
Zusammenfassung Im Rahmen dieser Arbeit wurden über 70 verschiedene Eisenbakterien, die aus eisenhaltigen Gewässern im Nationalpark Unteres Odertal und in Feuerland für unsere AG von Bertram Schmidt isoliert wurden, auf die Synthese von Sekundärmetaboliten und auf extrazelluläre Enzymaktivitäten untersucht. Untersucht wurden insbesondere Vertreter der Sphaerotilus-Leptothrix-Gruppe, der Actinobacteria-Gruppe und ein Stamm aus dem Phylum Chloroflexi. Da diese Organismen in ihrer Morphologie, ihrem Lebenszyklus und ihrem Energiestoffwechsel über viele Besonderheiten verfügen, wurden sie für eine Suche nach Sekundärmetaboliten eingesetzt. Mit einer Kombination von biologischen, chemischen und molekularbiologischen Screeningverfahren wurde eine breit angelegte Suche nach potentiellen Sekundärstoffproduzenten durchgeführt. Ein biologisches Screening mittels Agardiffusionsassay sollte biologisch aktive Stoffe nachweisen. Dabei zeigten nur Extrakte einiger Kineosporia-Stämme antagonistische Wirkung gegenüber zwei Pilzen, während die Extrakte aller anderen Stämme keine Aktivitäten aufwiesen, obwohl sie aufgrund der Daten der 16 S rDNA-Sequenzierung mit den Wirkstoffproduzenten sehr nah verwandt sind. Bei dem chemischen Screening wurde ein Teil der Bakterien auf ihr Metabolitenspektrum mittels LC-MS und NMR hin untersucht. Es zeigte sich, dass viele der untersuchten Rohextrakte unauffällig waren und es konnten bei vielen Stämmen auch bei Variation der Kulturbedingungen Sekundärmetabolite nicht eindeutig nachgewiesen werden. Nur Extrakte aus Kineosporia-Stämmen zeigten ein interessantes Metabolitenprofil, da sie Signale im aromatischen Bereich aufwiesen, die nicht aus dem Kulturmedium stammten. Das Metabolitenspektrum wird in laufenden Untersuchungen durch eine Fraktionierung ihrer Extrakte noch eingehender untersucht. Signale im aromatischen Bereich wurden nur beobachtet, wenn Kineosporia-Stämme in Sojamehl-Mannit-Medien als Flüssigkulturen kultiviert wurden, bei Oberflächenkulturen auf demselben Medium traten sie nicht auf. Durch den Einsatz unterschiedlicher Medien wurde in dieser Arbeit der Einfluss der Medienzusammensetzung auf die Produktion von Sekundärmetaboliten untersucht, mit dem Ziel, möglichst geeignete Bedingungen für die Produktion interessanter Sekundärmetabolite zu finden. Hierbei erwies sich das SM-Medium als am besten geeignet. Die Suche nach Sekundärmetaboliten mittels MALDI-TOF-MS Analyse von Kulturextrakten lieferte keine verwertbaren Aussagen, da in den vorhandenen Datenbanken keine Informationen über Referenzspektren für den Vergleich mit den aufgefundenen dominierenden Peaks zur Verfügung standen. Ein Teil der Bakterien wurde auf die Bildung von Acyl-Homoserinlaktonen (AHL) durch den Einsatz verschiedener AHL-Indikatorstämmen untersucht, um zu prüfen, ob dieser Typ von Signalmolekülen für die intraspezifische Kommunikation genutzt wird. Hier zeigten nur Pseudomonaden positive Ergebnisse. Anscheinend spielen die AHL bei den anderen untersuchten Bakteriengruppen keine Rolle und die Kommunikation erfolgt bei ihnen möglicherweise durch andere Mechanismen oder es kann durch die eingesetzten Indikatorstämme nicht detektiert werden. Des Weiteren wurde die Fähigkeit zur Bildung von Sekundärmetaboliten auf genetischer Ebene untersucht, wobei spezifische Primer zum Nachweis von Genen des Sekundärstoffwechsels (PKS und NRPS) eingesetzt wurden. Dabei konnten insbesondere bei allen Tetrasphaera-Stämmen NRPS-Gene nachgewiesen werden. Da das chemische Screening für diese Stämme aber keine interessanten Befunde erbrachte, sollten weitere Untersuchungen zur Optimierung der Kulturbedingungen nach dem OSMAC-Konzept für eine maximale Expression der Gene durchgeführt werden.
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