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Entwicklung von gfp-basierten Monitoring Tools zur Verfolgung von horizontalem Gentransfer und Studien zum T4SLS des konjugativen Plasmids pIP501 aus Enterococcus faecalis
Zitatschlüssel Arends2010
Autor Karsten Arends
Jahr 2010
Schule Technische Universität Berlin, FG Umweltmikrobiologie
Zusammenfassung Die Entstehung multi-resistenter Bakterien stellt eine immer größer werdende Gefahr für den Menschen dar. Hauptsächlich über bakterielle Konjugation findet ein horizontaler Austausch von Antibiotikaresistenz- und Virulenzgenen statt. Während aber der Mechanismus der Konjugation in Gram negativen Bakterien intensiv untersucht worden ist, sind Erkenntnisse zur Konjugation in Gram positiven Bakterien erst in den letzten Jahren entstanden. Als Modell für den konjugativen Transfer in G+ Bakterien diente in dieser Studie das konjugative, multi-resistente Plasmid pIP501 aus Streptococcus agalactiae, das einen ausgesprochen weiten Wirtsbereich hat. Zur Detektion und Verfolgung von horizontalem Gentransfer wurden auf Basis der pIP501 tra Region GFP-markierte, mobilisierbare und konjugative Plasmide konstruiert. Hierfür wurden die oriTpIP501 Region und die oriT-spezifische Relaxase bzw. die gesamte trapIP501 Region sowie ein optimiertes gfp Gen in die shuttle Vektoren pMSP3535 und pMSP3535VA unter Kontrolle des durch Nisin induzierbaren Promotors nisA kloniert. Für ein proof of principle wurde das mobilisierbare, GFP-markierte Plasmid pVA-GFP in bi- und triparentalen Kreuzungen mit pIP501 als konjugativem Plasmid von Enterococcus faecalis in verschiedene Bakterienstämme mobilisiert. Für eine molekulare Analyse des Mobiloms G+ Bakterien wurden PCR Assays zum Nachweis von pSK41/pGO1- und pIP501-ähnlichen Transfergenen sowie verschiedener MOBV, MOBQ und MOBP Relaxasen erstellt. In dem klinischen Isolat E. faecalis T9 wurden pSK41-ähnliche Transfergene nachgewiesen. Es konnte eine Retromobilisierung des Plasmids pVA-GFP von E. faecalis OG1X nach E. faecalis T9 und eine Mobilisierung des Plasmids pVA-GFP von E. faecalis T9 nach Bacillus subtilis gezeigt werden. Im zweiten Teil der Dissertation konnten 9 der 15 pIP501 Tra Proteine über Zellfraktionierungen von E. faecalis JH2-2 (pIP501) in vivo lokalisiert werden. Bis auf Orf14, das zytoplasmatisch vorlag, lokalisierten alle weiteren untersuchten Tra Proteine in der Zellhülle von E. faecalis. Für Orf8 und Orf11 konnte eine Lokalisierung in vivo über STED Immunfluoreszenzmikroskopie erfolgen. Orf8 bildete Foci in der Zellhülle von E. faecalis, während Orf11 zufällig verteilt in der gesamten Zellhülle vorlag. Die DNA-Bindung der Tra Proteine Orf8, Orf10, Orf11 und Orf14 wurde mit Gelshiftexperimenten untersucht. Orf10 zeigte spezifische Bindung an einzelsträngige DNA, während Orf14 bevorzugt mit doppelsträngige DNA interagierte. Bindungen von Orf11 an doppel- und einzelsträngige DNA konnten nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die VirB1-ähnliche lytische Transglykosylase Orf7 essentiell für den konjugativen Transfer von pIP501 ist. Mit den erhaltenen Daten wurde das T4SLS Arbeitsmodell für pIP501 modifiziert.
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